细胞培养是细胞生物学研究的第一步。在细胞培养过程中，为了确保细胞的健康生长，实现下游实验的顺利进行，研究人员需要测定细胞生长曲线，了解其生长情况，因而在细胞培养过程中及实验前都需要用细胞计数仪对细胞样品进行计数，检测活率和浓度。细胞计数的常见方法包括：手动计数及自动计数。本文将为您详述这两种计数方法，并对其进行优劣势对比。

一.手动细胞计数

18世纪，由法国解剖学家和组织学家 Louis-Charles Malassez发明的血球计数板人工手动活细胞计数方法一直被视为细胞计数的金牌标准。

手动细胞计数操作流程：

1.收集细胞并染色

收集细胞悬液，使用准备好的台盼蓝或AO/PI染料对细胞进行染色。

2.清洁计数板

取出血球计数板，用清水冲洗表面，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。

3.盖上盖玻片并上样

将清洁干燥的血球计数板平置于台面上，加盖专用的盖玻片形成计数室，用移液器吸取细胞悬液，滴于盖玻片边缘，让样品自动缓慢渗入，一次性充满计数室并均匀分布，防止产生气泡。

4.显微镜观察定位

在显微镜下找到合适的视野，对细胞样品进行观察，通过调焦让视野清晰，找到目标方格。如使用AO/PI染料，应使用荧光显微镜进行观察。

计数板的计数面积

5.镜下手动计数

通过移动不同视野，重复计数3次。

6.统计浓度并计算

根据换算公式和已经记录的数据，计算样品中的细胞浓度，如果是台盼蓝染色的细胞要将活细胞和总数分开计数。

7.清洁血球计数板

同上述方法清洁血球计数板后留作下次使用。

应用范围：

低通量/频率细胞计数

注意事项：

1、不完全清洁的血球计数板可能会导致生物安全问题

2、由于血球计数板的材质问题，表面易造成划痕严重影响实验结果

3、杂质残留易造成细胞分布不均

4、清洁剂残留可能会影响细胞活性

5、少量聚团细胞按照一个细胞计数，聚团较多的样品需要重新吹打混匀再重新计数

6、关于压在刻线上的细胞的计数原则要提前规定好

二.自动细胞计数

血球计数板计数虽被视为细胞计数的金标准，但由于血球计数板计数自身设计及使用方法，导致计数存在一些固有问题。为了消除这些问题， 自动细胞计数仪应运而生。

常见的自动细胞计数仪有三种：分别是图像式自动细胞计数仪、库尔特式自动细胞计数仪以及流式细胞仪。其中图像式细胞计数仪由于计数快速且原理最接近金标准的人工多次手工计数的结果，其原理通过仪器对细胞样品的图像识别，从而对细胞浓度和大小等参数运用算法进行自动快速的分析。进而可以了解细胞的生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度。

自动细胞计数仪计数操作流程

应用范围：

自动细胞计数仪可以根据不同的实验场景搭配相应的荧光通道进行计数。

注意事项：

• 根据实际样本进行圈选参数设置

• 已稀释样品计数需提前设置预稀释倍数

• 复杂样品需检查成像焦距是否设置正确，如有偏差及时微调修正

手动 VS 自动

优点缺点对比

总结：

手动细胞计数——血球计数板计数可能造成数据误差，且对血球计数板不规范的清洗操作可能造成生物危害。

自动细胞计数——计数精准，速度更快，可以提高实验效率。此外可以在机器本身拓展荧光功能，应用范围更广。

此外，USP-NF（美国药典）建议至少选用两种及以上方法对复苏后的细胞进行活率检测，除了明场下台盼蓝染色外，常用AO/PI染色法在荧光光场下进行活细胞计数，因此带有荧光功能的自动细胞计数仪则可更方便对细胞样品进行快速明场检测和荧光检测，所以使用自动化的仪器进行细胞计数更加适用于目前的细胞生物学研究场景。

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